Расы дрожжей, применяемые в производстве пива, и их физиологические особенности. Различия между расами винных дрожжей Расы дрожжей
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
ТЕМА №2 .
МИКРООРГАНИЗМЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДС Т ВАХ
2.1. ДРОЖЖИ
2.1.6. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДРОЖЖЕЙ. РАСЫ И ШТА М МЫ
Биотехнологические свойства пивных дрожжей
Вид: S.cerevisiae
Биотехнол.св-ва п.др. - 10 свойств, прочитаны.
Расы и штаммы пивных дрожжей
Раса 11 - самая популярная в России, идеал пивных дрожжей. С 1939 г. Быстросбраживающая, отсутствует глюкозная репрессия, неприхотлива к сырью (несоложеные материалы), используется для сбраживания плотного сусла (до 22% СВ), О 2 -независима, пиво хорошо осветляется.
Общая характеристика пивных рас и штаммов
Неприхотливы к сырью: 11, 776.
Очень требовательны к сырью: 34, 308.
Высокая скорость размножения: 11, 776, 8аМ, f-чешская.
Быстросбраживающие: 11, 8аМ, f-чешская, 70, 34, 308.
Глубоковыбраживающие: Ф-2(гибридная, декстрины, до 93%), 776, 11, 8аМ, 34, 308.
Для сбраживания плотного сусла: 11, 776, 8аМ, 41, 46, S-львовская.
Пиво хорошо осветляется из-за хорошей флокуляции: 11, 776, 8аМ, 41, 46.
Устойчивость к инфекциям: f-чешская.
Для жесткой воды: 41, 46.
Степень популярности рас в России: 11 - 44,5% заводов России; 8аМ - 34,1%; 776 - 4,1%; 44, S-львовская, 34, 308 - 10%. На остальные (f-чешская, 41, 46, 70 и др.) - менее 10%.
Часто стали использовать верховые: Hensen, Egh, Верховые-2, Верховые-32.
N.B.!!! Часто используют комбинацию штаммов, но совмещать можно штаммы только с одинаковой скоростью размножения!!!
АСПД - активные сухие пивные дрожжи. Их получают в асептических условиях (т.е. это ЧК) и они обладают ксерорезистенстностью (К). К - способность сохранять жизнеспособность при обезвоживании и длительном хранении в обезвоженном состоянии.
Технология получения и применения АСПД была разработана в 1994 г. в России Мелединой для Российского пивоварения и пива в домашних условиях (аналог инстантным хлебным дрожжам).
Достоинства АСПД: жизнеспособность клеток АСПД - не 90%; длительное сохранение биотехн.св-в - 6 мес. при 4-10 о С; положительное влияние на вкусовой профиль пива (низкое содержание спиртов, лет.кислот).
Дозировка АСПД, приготовленных в лаборатории м/о, биохимии, технологии дрожжей С-Пбр. 10-15 г/л (расы 8аМ, 11, 34, 129, 140, 145, 146, 148 - низовые).
Дозировка АСПД, приготовленных в Финляндии (Crown - верховые) - 70 г/л.
Также готовятся АСПД в DVL, Великобритании (Safbrew S-33 верховые и низовые; Saflager-23 низовые).
Биотехнологические свойства спиртовых дрожжей
Виды: S.cerevisiae, Schizosaccharomices pombe
1. Высокая бродильная активность.
2. Иметь и сохранять анаэробный тип метаболизма.
3. Микробиологическая чистота.
4. Устойчивость к продуктам своего ОВ и ОВ других м/о.
5. Устойчивость к резким изменениям состава среды, особенно к большим концентрациям солей и СВ ((осмоустойчивость).
6. При переработке мелассы полностью сбраживать раффинозу.
Расы и штаммы спиртовых дрожжей
При переработке зерна и картофеля используются пылевидные расы (верхового брожения): XII, II, XV, M, К-81, гибрид 69, S.pombe 80. Эти расы нельзя использовать для сбраживания мелассы, т.к. у них нет ферментов, сбраживающих раффинозу, и они неустойчивы к высокому содержанию СВ, что характерно для мелассы.
Раса XII: до недавнего времени наиболее часто используемая раса, но раффинозу сбраживает на 1/3, не сбраживает декстрины (похожи и хуже II, XV, M).
К-81 и S.pombe 80: используются вместе. Термотолерантны (до 35-36 о С), а также частично гидролизируют и сбраживают конечные декстрины. Это позволяет ускорить брожение, увеличить выход спирта, снизить расход хладоагента. Также они в 2-2,5 раза образуют больше в.спиртов и в 2-10 раз меньше глицерина, чем XII.
В производстве спирта перспективнее использовать гибридные расы дрожжей, т.к. в результате мутаций или гибридизаций они имеют фермент -галактозидазу и могут сбраживать раффинозу, выше скорость размножения, лучше хлебопекарные свойства..
Гибрид 69: по сравнению с XII лучше размножается в зерновых заторах, дольше сохраняет биохимическую активность, обладает амилолитической активностью
При переработке мелассы используются осмофильные расы: Я, Ял, В, Вл, В 30 , гибриды Г-67, Г-73, Г-75, Г-112, У-563, Г-105 и др.
Негибридные расы отличаются высокой бродильной активностью, устойчивостью к СВ, серной кислоте, солям, спирту; после работы их биомасса используется как хлебопекарные дрожжи, но сбраживают раффинозу на 1/3.
В 30: выше генеративная способность, устойчивость к ввам, хлебопекарные качества, раффинозу сбраживают на 70-80%.
Гибриды лучше, имеют фермент мелибиазу=-галактозидазу, сбраживают раффинозу на 100%, хлебопекарные свойства бывают лучше, чему у хлебных. Но могут потерять свои полезные свойства.
Биотехнологические свойства хлебопекарных дро ж жей
Вид: S.cerevisiae
3. Высокая подъемная сила (не более 70 мин до 70 мм)
4. Высокая зимазная (-фруктофуранозидазная, 45-60 мин) и мальтазная (-глюкозидазная, 60-90 мин) активности.
5. Высокая стойкость при хранении в прессованном и сушеном виде (0-20 о С не менее 20 сут.)
6. Устойчивость к мелассной среде (к резким изменениям состава среды, особенно к большим концентрациям солей и СВ)
Расы и штаммы хлебопекарных дрожжей
С 1860 г. по 1939 на дрожжевом производстве используются спиртовые расы дрожжей, не специализированные.
В 1939 г. была выделена раса Томская. Она неплохая, но требовательна к ростовым ввам и имеет низкую мальтазную активность (160 мин).
Одесская раса 14: выделена в 1954 г. из импортных сушеных дрожжей. По всем параметрам лучше Томской (кроме ростовых вв) и является основой для селекции остальных дрожжей.
В настоящее время выбор хлебопекарных рас большой.
Штамм Я-1: устойчив к Т (до 37-38 о С), подходит для южных районов.
Гибриды Г-176, Г-262, Г-296-6: зимаз. 42-57, мальт. 65-75; для получения сушеных дрожжей, т.к. содержат много трегалозы (до 8,7%).
Г-512: триплоид, с повышенным синтезом витаминов.
ЛВ-7, 739, 722, Л-1-Л-3 и много других.
N.B.!! Имеется зависимость: штаммы, обладающие наибольшей бродильной активностью, хуже сохраняются и теряют свои свойства при высушивании.
Биотехнологические свойства винных дро ж жей
При сбраживании виноградного сусла используют либо естественную, дикую микрофлору винограда, либо ЧКВД.
Брожение на диких дрожжах или спонтанное брожение рационально использовать при нормальном составе виноградного сусла и благоприятных температурных усвлоиях брожения. При этом в сусле сначала развиваются Hanseniaspora apiculata, затем S.vini, S.oviformis, S.uvarum.
Брожение на ЧК лучше использовать при каких-либо отклонениях состава сусла или невозможности создать/поддержать нормальные условия брожения. Применяют дрожжи рода S., видов S.vini, S.cerevisiae, S.oviformis, S.bayans.
1. Высокая бродильная активность (скорость образования СО 2)
2. Высокая продуктивность (скорость роста)
3. Высокая скорость размножения (выше, чем у диких дрожжей, или придется много вносить, чтобы не вытеснили).
4. Устойчивость к посторонним м/о сусла (бактериям, мицелиальным грибам) и продуктам их ОВ.
5. Отдельные свойства ВД диктуются условиями производства вина: устойчивость к кислотности, SO 2 , Т о и др.
Расы и штаммы винных дрожжей
Высокая кислотность сусла: Феодосия 1-19, судак II-9.
Сульфитостойкость: Берегово-2, Феодосия 1-19, Севлюш-72.
Спиртоустойчивость: Середне-191, Ужгород-671.
Холодостойкость: Кахури-7, Бордо-20.
Термостойкость: Ашхабадская-3, Туркменистанская 36-5.
Используются смеси рас, все чаше - сухие винные дрожжи.
Биотехнологические свойства квасных дро ж жей
Вид: S.minor.
Биот.свва квасных дрожжей обусловлены ограниченной их ролью при получении кваса.
Квас - это продукт молочнокислого и незаконченного спиртового брожения. В результате МКброжения сахара квасного сусла превращаются МКБ в молочную кислоту (кислотность), другие вва (укс.к-та, этанол, СО 2 , летучие аромат.в-ва).
В результате СПброжения сахара квасного сусла превращаются в СО 2 и небольшое количество этанола (до 0,5%). В результате взаимодействия продуктов МКброжения и СПб накапливается до 0,04% уксусно-этилового эфира и диацетила, которые создают специф. аромат и вкус кваса, повышают его стойкость.
1. Хорошая бродильная активность (обычно сбраживают только глюкозу и сахарозу)
2. Высокая кислотоустойчивость по сравнению с сахаромицетами.
3. Хорошее осаждение при охлаждении.
4. Устойчивость к автолизу.
5. Мягкий и приятный вкус и аромат кваса.
Расы и штаммы квасных дрожжей
Квасные дрожжи рас: М; 131; К; С-2.
Вместо квасных S.minor используют:
Винные высокопродуктивные низовые S.vini: Штейнберг-6, Киевская, Днепропетровская.
Пивные низовые S.cerevisiae: 497, 34/70.
Хлебопекарные высокопродуктивные S.cerevisiae: ЛВ3.
Подобные документы
Способы получения пекарских дрожжей. Промышленное производство дрожжей без запаха и вкуса. Особенности получения данного продукта методом химической активации. Характеристика и технология получения винных дрожжей с высокой бродильной активностью.
реферат , добавлен 08.12.2014
Химический и витаминный состав сухих пивных дрожжей, технология их производства. Строение и принцип работы установки производства чистой массовой культуры, дрожжегенераторов и вальцовых вакуум-сушилок. Правила промывки и хранения конечного продукта.
реферат , добавлен 24.11.2010
Производство хлебопекарных дрожжей на мелассно-дрожжевых предприятиях. Технологические режимы переработки мелассы различного качества. Схема получения маточных дрожжей по режиму ВНИИХПа. Хранение, сушка, формовка, упаковка и транспортировка дрожжей.
курсовая работа , добавлен 19.12.2010
Состав и свойства кормового дрожжевого белка. Производство кормовых дрожжей на зерно-картофельной барде. Технология переработки зерновой барды в сухие кормовые дрожжи, использующая непатогенный штамм Rhodosporium diobovatum. Выращивание товарных дрожжей.
презентация , добавлен 19.03.2015
Изучение и воспроизводство различных видов пивных дрожжей. Аппаратно-технологическая схема производства пива. Основные этапы процесса пивоварения: соложение, варка, брожение, дображивание, осветление, созревание, фильтрация, пастеризация и розлив.
курсовая работа , добавлен 19.12.2010
Химический состав кормовых дрожжей. Сырьё и вспомогательные материалы. Оптимальные условия культивирования кормовых дрожжей на мелассной барде, стадии данного процесса. Аппаратурно-технологическая схема производства кормовых дрожжей на мелассной барде.
курсовая работа , добавлен 19.12.2010
Потребление углеводов клеткой дрожжей. Практическая значимость усвоения углеводов клеткой. Практическое значение спиртового брожения. Синтез углеводов в клетке. Азотный, жировой, минеральный обмен дрожжей. Значение кислорода в метаболизме дрожжей.
лекция , добавлен 21.07.2008
Основные приемы и методы технологических расчетов в бродильных производствах, приведены необходимые формулы и справочные материалы, рассмотрены примеры решения задач. Для приготовления пива кроме ячменного солода используют несоложеный молотый ячмень.
методичка , добавлен 21.07.2008
Общая схема работы промышленного вакуум-фильтра. Экспериментальные исследования организации технологического процесса фильтрования дрожжевой суспензии. Характеристика путей сокращения затрат на организацию процесса изготовления хлебопекарных дрожжей.
статья , добавлен 24.08.2013
Характеристика микрофлоры дрожжевого производства. Процесс выращивания белковых дрожжей. Среды, применяемые для их производства. Описание технологической схемы получения дрожжей. Расчет материального баланса дрожжевого отделения биохимического завода.
ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ ВИННЫХ ДРОЖЖЕЙ
Различия между расами винных дрожжей.
Сбраживание стерильного виноградного сока в лабораторных условиях с применением дрожжей разных рас позволяет сравнивать их между собой. Давно известно, что расы винных дрожжей различаются по скорости размножения, скорости сбраживания сусла, сульфитостойкости, термо- и холодостойкости, кислотовыносливости, скорости осветления вина в связи с образованием пылевидных или хлопьевидных (конгломератных) осадков.
Чистые культуры дрожжей различаются и по спиртообразующей способности, определяемой по количеству образованного спирта при сбраживании сусла с повышенным содержанием сахара, и по спиртовыносливости, т. е. способности размножаться в винах с разной спиртуозностью.
Перечисленные свойства используются при выборе культуры дрожжей для сбраживания сусла в различных условиях. Так, в сусло, содержащее повышенное количество свободной сернистой кислоты (более 20 мг/л), рекомендуется вносить сульфитостойкие расы дрожжей; при низкой температуре сусла и окружающего воздуха (ниже 15°С) -холодостойкие культуры; при высокой температуре (выше 30°С) -термостойкие, при высокой кислотности (величина pH сусла ниже 3,0) - кислотовыносливые, при высоком содержании сахаров сусла (выше 22%) и необходимости полного сбраживания - расы дрожжей, обладающие высокой спиртообразующей способностью, для возобновления брожения вина - спиртовыносливые. При необходимости возможно большего контакта дрожжей со средой вносят расы дрожжей, образующие пылевидные осадки, а для бутылочной шампанизации для облегчения ремюажа и дегоржажа - расы дрожжей, образующие хлопьевидные осадки. Некоторые расы дрожжей с перечисленными выше свойствами приведены в табл. 27.
Установлены различия между винными дрожжами по пенообразующей способности. Показано, что расы дрожжей вида Sacch. uvarum сбраживают сусло без пены . Дрожжи этого вида накапливают повышенные количества глицерина и характеризуются холодостойкостью .
Кроме основного продукта брожения-этилового спирта - дрожжи-сахаромицеты
накапливают вторичные и побочные продукты брожения в различных соотношениях.
Многие из них уча-
ствуют в образовании аромата молодых вин. Сюда относятся высшие спирты, эфиры, жирные кислоты, альдегиды, диацетил и ряд других соединений.
Литературные данные, относящиеся к изучению образования высших спиртов при сбраживании виноградного сусла, свидетельствуют, что этот процесс зависит от состава сусла, степени его осветления, условий аэрации, стадии брожения и расы дрожжей. Проведенные нами определения показали, что разные расы винных дрожжей образовывали высших спиртов при сбраживании сусла от 80 до 500 мг/л. Наименьшее их количество было в вине при сбраживании сусла расой дрожжей Магарач 17-35 вида Sacch. oviformis и наибольшее - расой Яблочная 17 вида Sacch. vini. Культуры были рекомендованы для испытаний при приготовлении коньячных виноматериалов в Молдавии. Испытания показали целесообразность применения культур, образующих небольщие количества высших спиртов, для: получения 148 коньячных виноматериалов, так как высшие спирты при перегонке концентрируются. Виноматериал, полученный сбраживанием сусла на расе дрожжей Яблочная 17, был обогащен такими нежелательными компонентами, как изобутиловый, амиловый и изоамиловый спирты .
Образование летучих кислот, так же, как и высших спиртов, зависит от условий брожения и расы дрожжей. Количество летучих кислот колебалось в пределах 0,7-1,08 г/л при сбраживании сусла несколькими сотнями штаммов вида Sacch. ellipsoideus . Показано, что расы дрожжей образуют одинаковый набор летучих кислот (уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую, капроновую, каприловую), но количества их различны. Содержание уксусной кислоты составляет около 90% от суммы летучих кислот. Расы дрожжей Туркестанская 36/5, Романешты 46, Яблочная 17 образуют на 0,4-0,5 г/л летучих кислот больше, чем Шампань Аи, Судак VI-5 вида Sacch. vini .
Состав фракций летучих сложных эфиров вин зависит от вида, расы дрожжей и условий брожения. Однако о роли отдельных эфиров в сложении вкусовых и ароматических свойств вина наши сведения еще недостаточны, кроме этилацетата, который легко обнаруживается органолептически и образуется в значительно больших количествах дрожжами пленчатыми и апикулятусами, чем сахаромицетами .
Н. И. Бурьян и сотр. получены сведения о различиях между расами дрожжей по образованию диацетила и ацетоина. Расы Ркацители 6, Ленинградская образуют их меньше, чем Ка-хури 7, Штейнберг 1892 г., Шампань Аи. Высказывается предположение, что присутствие в винах сниженных количеств высших спиртов, ацетоина, диацетила и незначительных количеств высококипящих летучих кислот будет играть положительную роль в образовании аромата вин.
Установлены различия между расами дрожжей по способности образовывать пировиноградную и а-кетоглутаровую кислоты, которые связывают свободную сернистую кислоту и снижают ее антисептическое действие . Показано, что некоторые штаммы дрожжей могут образовывать при брожении сероводород из H2SO3 и элементарной серы и придавать вину сероводородный тон. В Австралии проведена селекция рас дрожжей, не образующих сероводорода даже в присутствии элементарной серы, попадающей в сусло с ягод винограда, обработанных серой. Сообщается о резком снижении сероводородного тона в винах в результате применения отселекционированных рас дрожжей .
Появились работы, в которых сообщается о различиях между расами винных дрожжей по потреблению яблочной кислоты в процессе брожения сусла . Некоторые расы дрожжей способны разлагать почти половину яблочной кислоты, а другие-- очень немного . Вероятно, можно будет отобрать расыдрожжей с минимальной способностью поглощения яблочной кислоты и использовать их для сбраживания низкокислотных сусел и, наоборот, расы дрожжей с максимальным потреблением яблочной кислоты, которые будут снижать кислотность при брожении высококислотных сусел.
Определение активности ферментов пектинрасщепляющего комплекса у 292 рас дрожжей-сахаромицетов показало, что они различаются по активности пектинэстеразы и полигалактуроназы, т. е. по способности расщеплять пектиновые вещества .
Появилось сообщение о том, что замечена разница между расами дрожжей по фиксации пигментов. Возможно, это свойство будет учитываться при отборе рас дрожжей для виноделия по красному . В настоящее время для приготовления красных вин рекомендуются культуры, выделенные из красных вин, имеющие названия Бордо, Каберне 5 и др.
Ассимиляция аминокислот дрожжами из среды происходит сложными биосинтетическими путями, включая переаминирование. Исследование некоторых трансаминаз показало, что расы винных дрожжей обладают разной активностью этих ферментов и она остается достаточно высокой у некоторых культур при выдержке вина на дрожжевом осадке. Ферментные концентраты, приготовленные из разных рас винных дрожжей, различаются по содержанию в них аминокислот и витаминов группы В, в связи с чем возможно индивидуальное воздействие того или иного ферментного концентрата на качество вина. Для получения ферментных концентратов рекомендуется раса Феодосия 1-19 .
Показано, что на размножение молочнокислых бактерий, вызывающих яблочно-молочное брожение, влияет штамм дрожжей, на котором проходит спиртовое брожение. Высказано предположение, что штаммы дрожжей могут выделять стимуляторы и ингибиторы размножения молочнокислых бактерий .
Установлена связь между спиртовыносливостью рас дрожжей, их выживаемостью и образованием больших количеств альдегидов при выдерживании виноматериалов на дрожжевых осадках в условиях ограниченного доступа воздуха к виноматериалу. Для накопления альдегидов при получении хереса беспленочным методом рекомендуется проводить сбраживание сусла и последующую выдержку вина на спиртовыносливых расах дрожжей вида Sacch. oviformis. К числу таких рас относятся Мага-рач 17-35, Ленинградская, Киевская.
Недавно получены данные о существовании антагонистических отношений между культурами дрожжей-сахаромицетов. Оказалось, что все они принадлежат к одному из трех фенотипов: убийца или киллер (killer - К), нейтральный (neutral - N), чувствительный (sensitive - 5). Киллеры вызывают гибель чувствительных культур при совместном развитии в виноградном сусле. Дрожжи, имеющие фенотип нейтральных, не убивают чувствительные и не погибают от действия киллеров. В связи с
тем что виноградное сусло, поступающее на брожение, нестерильно и содержит дрожжи разных фенотипов (К, N, S), целесообразнее для обеспечения брожения сусла на чистых культурах дрожжей вводить в него разводки более конкурентоспособных рас фенотипов К или N . Среди культур, имеющихся в коллекции дрожжей ВНИИВиВ «Магарач», такими свойствами обладают расы 47-/С и 5-N вида Sacch. vini, которые к тому же являются сульфитостойкими, что делает их еще более конкурентоспособными и позволяет им быстрее размножаться в сусле после его отстаивания с сульфитацией.
При изготовлении любого современного вина обязательно используются винные дрожжи. Они в процессе своего развития проходят такие стадии:
- Лаг-стадия. Она начинается с того момента, когда дрожжевые крупинки попадают в сусло – в питательную среду. Клетки начинают приспосабливаться к субстрату. Они увеличиваются в размерах, но при этом процесса размножения ещё нет;
- Вторую стадию называют логарифмической. Во время неё увеличивается популяция клеток, и биомасса становится больше. Клетки стойко выносят все отрицательные факторы внешней среды. Начинается брожение спирта;
- Третью стадию называют стационарной. Дрожжевые клетки прекращают расти, а спиртовое брожение происходит с интенсивной силой;
- Четвёртая стадия заключается в затухании роста клеток дрожжевой массы. Масса начинает уменьшаться в размерах благодаря интенсивному автолизу и использованию дрожжами резервных веществ.
Пройдя все четыре стадии, дрожжевая масса сделает любое вино вкусным и ароматным.
Всё об винных дрожжах
В природе дрожжи образовываются на поверхности ягод, например, на винограде. Их можно легко заметить, так как они обладают светлым налётом на кожуре ягодок. Налёт образовывается из-за работы дрожжевого грибка.
Пекарские, спиртовые, пивные и винные дрожжевые крупинки относят к производственным дрожжам. Учитывая место происхождения, сорт винограда и местонахождение виноградных плантаций каждому виду дрожжей присваивается своё имя. Дрожжевые расы в свою очередь можно разделить на группы. Вследствие этого расы винных дрожжей бывают:
- Высоковыбраживающими;
- Термоустойчивыми или холодостойкими;
- Спиртоустойчивыми;
- Хересными.
Спиртоустойчивые расы дрожжей применяются для изготовления шампанского, а хересные для придания винам неповторимого аромата и вкуса.
Вино обычно делают из сока винограда или других видов плодов и ягод.
Если происходит кустарное виноделие, сусло (отжатый сок) начинает бродить без помощи дрожжей, так как начинают интенсивно размножатся дрожжевые грибки, которые имеются на поверхности самих ягод. Одновременно с ними в силу вступают молочнокислые, уксуснокислые бактерии, дрожжеподобные грибы, которые могут привести к порче продукта, ну или получению винного уксуса вместо вина.
По этой причине вовремя промышленного производства вина, чтобы избежать порчи виноматериалов в виноградный сок добавляется активированная смесь винных дрожжей.
Тип вина зависит от того, каким образом происходит брожение. Благодаря винным дрожжам начинает бродить сахар, который входит в состав винограда. Брожение длится до тех пор, пока весь сахар не преобразуется.
При нехватке кислорода благодаря влиянию дрожжей получается спирт. Если кислород постоянно поступает, полностью окисляется сахар и получается вода с углекислым газом.
При первичных этапах развития дрожжей, брожение происходит интенсивно, из-за этого углекислый газ, который выделяется, не даёт проникать атмосферному кислороду к поверхности сусла. Когда брожение закончится, бочку с вином важно хорошо запечатать. Если этого не сделать, уксуснокислые бактерии превратят спирт в уксусную кислоту. Вместо вина вы станете обладателем винного или яблочного уксуса.
В промышленном производстве вин используется виноградный сок с содержанием 25 процентов сахара.
Чтобы получить белые вина, виноград очищается от кожуры и косточек. Для красных вин, кожуру и косточки не удаляют. Дрожжи для вина вместе с сахаром при брожении сок перерабатывают в спирт. Дрожжевые вещества придают вину ароматность и приятный вкус. После брожения для придания напитку запаха большую роль играют молочнокислые бактерии.
Разные разновидности вин имеют свои особенности производства. Например, чтобы получить шампанское, перебродившее вино нужно сбродить повторно. Брожение напитка должно закончиться в закрытой ёмкости, так как должна накопиться внутри углекислота.
Чтобы получить крепкое вино (херес), нужно воспользоваться специальными хересными дрожжами, которые стойкие к высокой концентрации спирта в виноматериале.
Разновидности вин
Вина бывают сухими, сладкими и креплёными. Чтобы получить сухое вино, важно брожение остановить сразу же после окончания запаса сахара в выдавленном виноградном соке.
Сладкие вина получают путём частичного сброжения сахара, когда достигается токсичный уровень спирта для винных дрожжей.
Креплёные вина дополнительно заливаются спиртом.
Из вышеописанного можно сделать вывод, что вид вина напрямую зависит от того, каким способом его производят, а также какой вид винных дрожжей используется для брожения сока.
Какие бывают дрожжи
Существует много различных видов винных дрожжей. Например, дрожжи для вина Lalvin KV-1118, Lalvin EC-1118 и другие. Давайте подробнее рассмотрим инструкцию по применению каждого вида дрожжей.
Первый вид
Винные дрожжи Lalvin KV-1118 являются чистым высокоактивным дрожжевым концентратом, который применятся для изготовления лёгких белых вин, красных вин и шампанского. Также с помощью таких дрожжей можно восстановить брожение.
Дрожжевую массу принято применять при низкой концентрации, низких температурах, низкому содержанию жирных кислот. Они отлично справляются со своей миссией в температурном режиме 10 – 35 градусов. Если в виноматериал добавить подпитку при температуре ниже 16 градусов, начнут вырабатывать сложные эфиры, которые придадут напитку насыщенный аромат. Благодаря выраженному киллер-эффекту, дрожжевые крупинки хорошо подавляют «дикую» микрофлору.
Инструкция по применению такого продукта говорит следующее:
- Применяются дрожжи со штампом KV для выражения виноградного аромата в белых, розовых и насыщенно красных винах;
- Учитывая тип и чистоту сырья, условия и длительность ферментации определяется нужная дозировка. Обычно она составляет от 1 до 4 г/дал;
- В их состав не входят никакие добавки. Они имеют влажность 6 процентов;
- Винные дрожжи (5 грамм) разводят в воде (50 миллилитров) 34 – 39 градусов. Чтобы они заработали нужным образом важно, чтобы вода была температуры не более 40 градусов. Затем смесь нужно хорошо перемешать, чтобы разбить комочки и выдержать не более двадцати минут. Спустя время снова перемешайте, и медленной струйкой введите в сусло. Медленное введение помогает дрожжам постепенно акклиматизироваться и не погибнуть при соединении с прохладным суслом;
- Хранить дрожжи для вина можно в тёмном сухом месте до пары лет. Температура хранения должна быть от пяти до пятнадцати градусов. Если вы открыли упаковку, срок годности у неё не больше полугода.
Второй вид
Винная дрожжевая масса Lalvin EC придаёт красным и белым винам освежающий вкус и чистоту. Они хорошо бродят даже при самых низких температурах, образуя осадок в одном месте. Благодаря такому виду сырья можно повторно запустить брожение. Его рекомендуется использовать для , а также из калины, боярышника и вишни. Продукт с пометкой EC обладает низким пенообразованием, хорошо осветляет вино и компактно собирает осадок. Инструкция по применению дрожжей со штампом EC говорит следующее:
- 300 грамм содержимого пакетика нужно высыпать в пять литров сорокаградусной воды. Тщательно размешайте до однородности;
- Когда температура смеси станет 35 градусов, аккуратно высыпьте 250 грамм дрожжей на поверхность. Дайте постоять 20 минут и хорошенько перемешайте. Затем полученную массу вылейте в сусло, таким образом, чтобы перепад температур был не выше десяти градусов;
- Хранить их можно в закрытой упаковке при температуре не больше восьми градусов тепла.
Приготовить вино из винограда не очень трудно. Важно только приобрести правильные дрожжи и внимательно изучить, что говорит инструкция. На ней обычно всё подробно написано.
Теперь вы знаете, что собой представляют дрожжи для вина. Каких они бывают видов. Как можно получить различные виды вин, используя разные виды изготовления. Любители виноделы всегда гордятся своими творениями, особенно если они нравятся окружающим людям.
2 Общая характеристика и расы дрожжей, применяемых в бродильных производствах
Культурные дрожжи относятся к семейству сахаромицетов и называютсяSaccharomyces cerevisiae.
Температурный оптимум для размножения дрожжей находится в пределах 25-30°С, а минимальная температура около 2-3°С. При температуре 40°С рост прекращается и дрожжи отмирают, но низкие температуры дрожжи переносят хорошо, хотя размножение их приостанавливается. Дрожжи не погибают даже при температуре –180°С (жидкий воздух). При высокой концентрации сахара в среде жизнедеятельность дрожжей прекращается, так как при этом увеличивается осмотическое давление, при определенном значении которого наступает плазмолиз дрожжевых клеток. Плазмолизом называется сжатие клетки с последующим отслоением протоплазмы от клеточной оболочки вследствие обезвоживания клетки и связанного с этим резкого падения давления клеточного сока. Величина предельной концентрации сахара для различных рас дрожжей неодинакова.
Различают дрожжи верхового и низового брожения. В каждой из этих групп имеется несколько отдельных рас.
Дрожжи верхового брожения в стадии интенсивного брожения выделяются на поверхности сбраживаемой среды в виде довольно толстого слоя пены и остаются в таком состоянии до окончания брожения. Затем они оседают, но редко дают плотный осадок на дне бродильного сосуда. Дрожжи верхового брожения по своей структуре принадлежат к пылевидным дрожжам, не склеивающимся друг с другом в отличие от хлопьевидных дрожжей низового брожения, оболочки которых являются клейкими, что приводит к агглютинации и быстрому осаждению клеток.
Дрожжи низового брожения, развиваясь в сбраживаемой жидкости, не переходят в поверхностный слой – пену, быстро оседают по окончании брожения, образуя плотный слой на дне бродильного сосуда.
Отличительным признаком является способность дрожжей низового брожения полностью сбраживать рафинозу, тогда как большинство дрожжей верхового брожения рафинозу совершенно не расщепляет, и лишь некоторые виды могут сбраживать ее только на одну треть. Это основное различие объясняется тем, что в ферментном комплексе названного типа дрожжей содержится α-галактозидаза.
Из культурных дрожжей к дрожжам низового брожения относится большинство винных и пивных дрожжей, а к дрожжам верхового брожения – спиртовые, хлебопекарные и некоторые расы пивных дрожжей. Первоначально были известны только дрожжи верхового брожения, так как брожение всяких соков происходило при обычной температуре. Желая получить напитки, насыщенные СО 2 , человек стал вести брожение при низкой температуре. Под влиянием изменившихся внешних условий получились дрожжи низового брожения с их свойствами, получившие широкое распространение.
Кроме общих свойств, дрожжи, используемые в том или ином производстве, обладают специфическими показателями. Более того, в одном и том же производстве применяются разновидности, различающиеся одной или несколькими особенностями. Их выводят из одной клетки. Такие культуры называют расами (штаммами). Каждое производство располагает несколькими расами дрожжей.
Расы дрожжей спиртового производства
В спиртовом производстве применяются те расы дрожжей верхового брожения, которые обладают наибольшей энергией брожения, образуют максимум спирта и сбраживают моно- и дисахариды, а также часть декстринов. Из дрожжей, применяемых при получении спирта из хлебно-картофельного сырья, следует назвать расы ХП, М и ХV.
При переработке мелассы на спирт применяют расы Я, Л, В, Г-67, Г-73. Эти расы относятся к семейству Saccharomyces taceae, роду Saccharomyces, виду cerevisiae.
Раса ХП выделена в 1902 году из хлебопекарных прессованных дрожжей. Клетки дрожжей этой расы круглые ияйцевидные размерами 5-6,2 х 5-8 мкм.
Развитие и размножение дрожжей расы ХП идет очень быстро. Они сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, мальтозу, маннозу, рафинозу на одну треть и могут образовывать в сбраживаемой среде до 13%об спирта.
Раса М (Mischung – смесь), предложенная Геннебергом в 1905 году, состоит из смеси четырех рас дрожжей верхового брожения; она предназначена для сбраживания сред, содержащих смесь различных сахаров (декстринов, рафинозы), которые неодинаково сбраживаются различными дрожжами. Такая смешанная культура очень устойчива против различных ненормальных условий, встречающихся в заводской практике.
Раса ХV по технологическим признакам сходна с расой ХП. Ее применяют наряду с расой ХП для сбраживания смешанного зерно-мелассного сырья.
Из названных рас наиболее пригодной для сбраживания сусла из крахмалистого сырья является раса ХП, которая применяется также в гидролизном и сульфитноспиртовом производствах. Правда, для сбраживания сульфитных щелоков выведены специально сульфитные дрожжи, сбраживающие глюкозу, фруктозу, галактозу и маннозу.
Дрожжи, применяемые на спиртовых заводах, перерабатывающих мелассу, должны обладать специфической способностью быстро сбраживать довольно концентрированные сахарные растворы и хорошо переносить высокое содержание солей в среде. Сбраживать же растворы, содержащие большие концентрации сахара, могут так называемые осмофильные дрожжи, которые выносят очень высокое осмотическое давление.
К таким дрожжам относится раса Я, выведенная из мелассных дрожжей К.Ю. Якубовским. Раса Я обладает исключительной способностью сбраживать высокие концентрации сахара и хорошо переносит высокое содержание солей и спирта в сбраживаемом мелассном сусле. Дрожжи расы Я сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, галактозу, мальтозу; рафинозу сбраживают только частично и совершенно не сбраживают декстрины и лактозу. Раса Я относится к пылевидным дрожжам верхового брожения.
Дрожжи расы Л (Лохвицкая) близки по своим свойствам к дрожжам расы Я, но они несколько лучше размножаются и более полно сбраживают сахар.
Раса В (венгерская) подобно расе Л приспособлена к мелассной среде. Эти расы хорошо сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу, а рафинозу частично.
Дрожжи рас Л и В наряду с высокими бродильными свойствами обладают также хорошей подъемной силой (способностью поднимать тесто), что позволяет выделять их из бражки и выпускать в прессованном виде в качестве хлебопекарных.
Успешное применение находят гибридные дрожжи, выведенные в Институте генетики АН СССР путем скрещивания двух видов дрожжей. Среди гибридов наибольший интерес представляют Г-67, Г-73. Гибрид 67 получен скрещиванием пивных дрожжей S-carlsbergensis с S.cerevisiae расы Я. Дальнейшее скрещивание гибрида 67 с гибридом 26 (полученным от скрещивания рас Я и ХП) дало гибрид 73. Гибриды 67 и 73 наряду с другими ферментами содержат α-галактозидазу и обладают способностью к полному сбраживанию рафинозы. Рекомендованы к применению и другие гибридные дрожжи.
Расы хлебопекарных дрожжей
В дрожжевом производстве ценятся быстро размножающиеся расы дрожжей, обладающие хорошей подъемной силой и хорошей стойкостью при хранении. Вкус хлебопекарных дрожжей должен быть чистый, цвет белый или желтоватый. Подъемная сила определяется как особенностями рас дрожжей, так и способом ведения производства. Стойкость дрожжей является свойством расы, но зависит от внутреннего состояния клеток и чистоты дрожжей.
При производстве хлебопекарных дрожжей из мелассы применяются расы VII, 14, 28 и Г-176.
Раса VII, выведенная из прессованных товарных дрожжей Томского дрожжевого завода, быстро размножается и хорошо отпрессовывается до влажности 71-72%. Дрожжи расы VII обладают хорошей подъемной силой и наибольшей стойкостью при хранении по сравнению с другими известными в заводской практике. Кроме того, эта культура является устойчивой к вредным примесям, содержащимся в мелассе.
Раса 14 предназначена для производства сухих дрожжей. Эти дрожжи отличаются плотной консистенцией при влажности 75%, высокой термоустойчивостью.
Из гибридов хлебопекарных дрожжей отобран гибрид 176, обладающий всеми положительными признаками: крупными клетками (5,6-14,0 мкм), устойчивостью к вредным примесям мелассы и высоким коэффициентом размножения, который у этой расы выше, чем у наиболее быстро размножающейся расы 14. В настоящее время проходят производственные испытания и другие перспективные гибридные расы дрожжей.
Расы пивных дрожжей
В пивоварении используют дрожжи низового брожения, приспособленные к сравнительно низким температурам. Пивные дрожжи должны быть микробиологически чистые, а также обладать способностью к хлопьеобразованию, быстро оседать на дно бродильного аппарата и давать прозрачный напиток с определенными вкусом и ароматом. К сильносбраживающим и легко дающим хлопья относятся пивные дрожжи низового брожения Фроберг (Saccharomyces cerevisiae Froberg), дрожжи рас V и 776.
На пивоваренных заводах большое распространение получили дрожжи расы 776, которая была выведена в начале XX в. Эти дрожжи считаются пригодными особенно для сбраживания сусла, приготовленного с добавкой несоложеных материалов или из солода, полученного солодованием ячменей с невысокой степенью прорастаемости. Дрожжи расы 776 –среднесбраживающие, за период главного брожения на сусле концентрацией 11% образуют примерно 2,7% СО 2 . Клетки яйцевидной формы, длиной 8-10 мкм и шириной 5-6 мкм. Прирост дрожжевой массы 1: 5,4. Способность к осветлению удовлетворительная.
Из других дрожжей на пивоваренных заводах применяются расы 11, 41, 44, S-Львовская и др, различающиеся по бродильной энергии, способности к осаждению и энергии роста.
Дрожжи расы 11 – сильносбраживающие, с хорошей способностью к осветлению. Пиво, полученное с применением дрожжей расы 11, имеет хороший вкус. Эта раса получила широкое распространение на пивоваренных заводах.
Дрожжи расы 41 – среднесбраживающие, с хорошей способностью к осаждению. При сбраживании сусла расой 41 получается мягкое пиво с чистым вкусом.
Дрожжи расы 44 – среднесбраживающие. Способность к осаждению хорошая. Сообщают пиву полноту вкуса и дают хорошие результаты при применении в производстве воды с повышенной жесткостью.
Дрожжи расы S – среднесбраживающие. Способность к осаждению хорошая. Дают пиво с мягким чистым вкусом.
Дрожжи расы Р – среднесбраживающие, хорошо осветляют пиво и обусловливают приятный чистый вкус.
Дрожжи расы F характеризуются хорошей способностью к осветлению и сообщают пиву приятный аромат. Раса устойчива к действию посторонних микроорганизмов.
Дрожжи расы А (выделены на рижском пивоваренном заводе «Алдарис») сбраживают сусло за 7-8 суток, хорошо осветляют пиво и устойчивы к инфекции.
Путем разных способов селекции во ВНИИ пивобезалкогольной промышленности получен ряд сильносбраживающих штаммов дрожжей (28, 48, 102), обладающих значительно большей бродильной энергией, чем дрожжи исходной расы 11.
Пивные дрожжи верхового брожения находят широкое применение в Англии при приготовлении Портера. Они применяются также для приготовления Берлинского светлого пива и других напитков. Для приготовления Бархатного пива применяют штамм 191 К, интенсивно сбраживающий моносахариды и мальтозу, но не сбраживающий сахарозу, рафинозу и лактозу.
Расы винных дрожжей
В виноделии ценятся дрожжи, быстро размножающиеся, обладающие свойством подавлять другие виды дрожжей и микроорганизмы и придавать вину соответствующий букет. Дрожжи, применяемые в виноделии, относятся к своеобразному виду Saccharomyces ellipsoideus. Клетки их имеют продолговато-овальную форму. Дрожжи энергично сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу и мальтозу. В различных местностях и из различных молодых вин выделено несколько отличающихся одна от другой разновидностей или рас этого вида. В виноделии почти все производственные культуры дрожжей – своего, местного происхождения. К их числу относятся расы Магарач 7, Массандра 3, Пино 14, Кахури и многие другие. Наряду с этими расами применяются и некоторые иностранные, например раса Штейнберг, выделенная в Германии в 1892 и 1893 гг., и раса Шампань-Аи.
Большая часть винных дрожжей относится к дрожжам низового брожения.
Для приготовления белых столовых вин применяются расы Пино 14, Феодосия 1/19, Алиготе, Рислинг Анапский.
Раса Пино 14 имеет клетки яйцевидной формы, хорошо сбраживает виноградное сусло сахаристостью 20 % с образованием 11,57%об спирта; оптимальная температура развития и брожения 18: -25°С. Эта раса является холодостойкой и кислотостойкой; оптимальная величина рН 2,9-3,9.
Раса Феодосия 1/19 – крупноклеточная, пылевидная, очень энергичная, быстро сбраживает виноградное сусло и хорошо дображивает его; имеет широкий температурный диапазон брожения (от 9 до 35°С) и может применяться как холодостойкая и как термостойкая.
Дрожжей Алиготе имеется несколько рас, и все они сильные, с высокой энергией брожения. К энергично сбраживающим относятся и дрожжи Рислинг Анапский.
Для приготовления крепких вин применяется раса Массандра 3 с яйцевидной формой клеток, пылевидная; оптимальная величина рН 3,7-4,05; оптимальная температура брожения 18-20°С. Виноградное сусло с содержанием сахара 20% сбраживается полностью; при сбраживании концентрированного виноградного сусла (30% сахара) образует 11,8%об спирта и оставляет несброженным 8,7% сахара.
Раса Магарач 125, названная в ознаменование 125-летнего юбилея первых посадок винограда в институте «Магарач», применяется для получения крепких и десертных вин. Эта раса хорошо сбраживает высококонцентрированные виноградные сусла с содержанием сахара 27-30%, холодостойкая.
Раса Кахури 2 широко применяется для приготовления шампанских виноматериалов и вин. Виноградное сусло с содержанием сахара 20% она сбраживает с образованием 11,4%об спирта, остается несброженным 0,28% сахара. Эта раса довольно холодостойкая (при температуре 14-15°С сусло забраживает на 2-й день) и сбраживает хорошо; оптимальная величина рН 3,4-3,6.
Раса Шампанская 7, применяемая для шампанизации вина в бутылках, выделена из расы Кахури 5 и характеризуется образованием трудно взмучивающегося осадка; интенсивно сбраживает при температуре 4-9°С, хотя сусло и забраживает только на 5-6-й день.
Из винных дрожжей наиболее холодостойкой считается раса Ленинградская, а наиболее термостойкой – раса Ашхабадская 3.
В производстве хереса применяются специальные расы дрожжей, которые являются разновидностью вида Saccharomyces oviformis. Хересные дрожжи образуют на поверхности вина в неполных бочках пленку, благодаря развитию которой вино приобретает особые букет и вкус.
Путем тщательного отбора по наиболее важным производственным признакам выделено несколько рас хересных дрожжей (13, 15 и 20) с высокой пленкообразующей способностью. В дальнейшем из производства, применявшего расу Херес 20, была отселекционирована более эффективная раса Херес 20-С, которая нашла широкое применение на многих заводах по производству хереса.
В плодово-ягодном виноделии применяются селекционированные расы дрожжей, выделенные из различных плодово-ягодных соков. Плодово-ягодные соки богаты дрожжами, обладающими всеми необходимыми для производства качествами и биологически приспособленными к условиям развития в исходных плодово-ягодных соках. Поэтому штаммы дрожжей, выделенных из земляничных соков, применяются для сбраживания земляничных соков, а штаммы дрожжей, выделенных из вишневых соков, применяются для сбраживания вишневых соков и т. д.
В плодово-ягодном виноделии получили распространение следующие штаммы: яблочные 46, 58, клюквенный 17, смородиновый 16, брусничные 3, 7, 10, малиновые 7/5, 25, 28, 28/10, вишневые 3, 6, земляничные 7, 4, 9.
Названные штаммы дрожжей обеспечивают нормальный ход брожения, полноту сбраживания, быструю осветляемость и хорошие вкусовые качества вина; они сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, галактозу и не сбраживают лактозу и маннит.
Успешно применяются в плодово-ягодном виноделии расы дрожжей Москва 30, Яблочная 7, Вишневая 33, Черносмородиновая 7, Малиновая 10 и Сливовая 21. Чистая культура дрожжей Москва 30 рекомендуется для сбраживания клюквенного сусла; Яблочная 7 и Вишневая 33 – для сбраживания яблочного сусла; Черносмородиновая 7 и Вишневая 33 – для сбраживания черносмородинового и вишневого сусла.
4 Химизм спиртового брожения. Вторичные и побочные продукты спиртового брожения
Спиртовое брожение представляет собой цепь ферментативных процессов, конечным результатом которых является распад гексозы с образованием спирта и СО 2 и доставка дрожжевой клетке той энергии, которая необходима для образования новых веществ, используемых для процессов жизнедеятельности, в том числе для роста и размножения. По химическому характеру спиртовое брожение – каталитический процесс, происходящий под действием биологических катализаторов – ферментов.
Современная теория спиртового брожения является результатом работ многих ученых различных стран мира.
Для выяснения процессов брожения большое значение имели работы выдающихся отечественных ученых: Лебедева, Костычева, Фаворского, Иванова, Энгельгардта.
По современным представлениям, спиртвое брожение – это сложный непрерывный процесс распада сахара, катализируемый разными ферментами с образованием 12 промежуточных продуктов.
1 Начальной стадией превращения глюкозы является реакция фосфорилирования ее при участии фермента глюкозиназы. К молекуле глюкозы присоединяется фосфатный остаток от молекулы АТФ, которая находится в клетках дрожжей, и образуется глюкозо-6-фосфат, а АТФ превращается в АДФ:
С 6 Н 12 О 6 + АТФ → СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 4 СНО+АДФ
Глюкоза Глюкозо-6-фосфат
В результате присоединения фосфатного остатка от молекулы АТФ к глюкозе реакционная способность последней возрастает.
2 Глюкозо-6-фосфат путем изомеризации под действием фермента глюкозофосфатизомеразы переходит обратимо в форму фруктозы:
СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 4 СНО → СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 ОН
СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН)3СОСН 2 ОН + АТФ →
Фруктозо-6-фосфат
→ СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 О(Н 2 РО) + АДФ
Фруктозо-1,6-дифосфат
Эфиры глюкозо-6-фосфат и фруктозо-6-фосфат образуют равновесную смесь, получившую название эфира Эмдена и состоящую на 70-75% из эфира Робисона (глюкозы) и на 25% из эфира Нейберга (фруктозы).
Образованием фруктозо-1,6-дифосфата заканчивается подготовительнаястадия спиртового брожения с переносом макроэргических фосфатных связей и с преобразованием гексозы в лабильную оксиформу, легко подвергающуюся дальнейшим ферментативным превращениям.
4 Следующим важнейшим этапом является десмолиз – разрыв углеродной цепи фруктозодифосфата с образованием двух
молекул фосфотриоз. Симметричное расположение остатков фосфорной кислоты по концам молекулы фруктозы облегчает разрыв ее углеродной цепи как раз в середине. Фруктозодифосфат распадается при этом на две триозы: фосфоглицериновый альдегид и фосфодиоксиацетон. Реакция катализируется ферментом альдолазой и обратима:
СН 2 О(Н 2 РО 3)(СНОН) 3 СОСН 2 О(Н 2 РО) → CH 2 О(Н 2 Р0 3)СОСН 2 ОН +
Фруктозо-1,6-дифосфат Фосфодиоксиацетон
СН 2 0 (Н 2 РОз) СНОНСНО (4)
З-фосфоглицериновый альдегид
Главная роль в дальнейших превращениях при спиртовом брожении принадлежит 3-фосфоглицериновому альдегиду, но в сбраживаемой жидкости он обнаруживается лишь в незначительном количестве. Это объясняется взаимным переходом ке-тозного изомера в альдозный и обратно под действием фермента триозофосфатизомеразы (5.3.1.1)
СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СОСН 2 ОН;£ СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСНО
Фосфодиоксиацетон З-фосфоглицериновый альдегид
По мере дальнейшего превращения фосфоглицеринового альдегида новые количества его образуются в процессе изомеризации фосфодиоксиацетона.
5. Последующим этапом является окисление двух молекул З^фосфоглицеринового альдегида. Эта реакция катализируется триозофосфатдегидрогеназой (1.2.1.12), коферментом которой является НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид). В окислении участвует фосфорная кислота среды. Реакция протекает по следующему уравнению: 2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСНО + 2Н 3 Р0 4 + 2НАД Триозофосфатдегидрогеназа ->
З-фосфоглицериновый альдегид
->- 2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСОО w (H 2 P0 3) + 2НАД Н 2 (5)
1,3-дифосфоглицериновая йислота
Молекула 3-фосфоглицеринового альдегида присоединяет фосфат, а водород переносится на кофермент НАД, который восстанавливается. Энергия, освобождающаяся в результате окисления 3-фосфоглицеринового альдегида, аккумулируется в макроэргической связи образующейся 1,3-дифосфоглицериновой
6. Далее фосфатный остаток 1,3-дифосфоглицериновой кисло
ты, содержащий макроэргическую связь, при участии фермента
фосфоглицераткиназы (2.7.2.3) переносится на молекулу АДФ.
Образуется 3-фосфоглицериновая кислота, а АДФ, приобретая
дополнительную макроэргическую связь, превращается в АТФ:
2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) СНОНСОО со (Н 2 Р0 3) + 2АДФ->2СН 2 0 (Н 2 Р0 3) CHOHCOOH+
1,3-дифосфоглицериновая кислота 3-фосфоглицериновая кислота
7. Затем под действием фермента фосфоглицеромутазы
(2.7.5.3) остаток фосфорной кислоты перемещается от третьего
углерода ко второму, и в результате 3-фосфоглицериновая кис
лота превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту:
2СН 2 (Н 2 Р0 3) CHOHCOOH ^t 2CH 2 0HCH0 (Н 2 Р0 3) СООН. (7)
3-фосфоглицериновая кислота 2-фосфоглицериновая кислота
8. Следующей стадией является дефосфорилирование 2-фос-
фоглицериновой кислоты. При этом 2-фосфоглицериновая кис
лота под действием фермента энолазы (4.2.1.11) путем дегидра
тирования (потери воды) превращается в фосфоэнолпировино-
градную кислоту:
2СН 2 ОНСНО (Н 2 Р0 3) СООН qt 2СН 3: СО со (Н 2 Р0 3) СООН + 2Н 2 0. (8)
2-фосфоглицериновая кислота Сосфоэнолпировиноградная кислота
При этом превращении происходит перераспределение внутримолекулярной энергии и большая ее часть аккумулируется в макроэргической фосфатной связи.
9. Весьма нестойкая фосфоэнолпировиноградная кислота
легко дефосфорилируется, при этом остаток фосфорной кислоты
под действием фермента пируваткиназы (2.7.1.40) передается
вместе с макроэргической связью молекуле АДФ. В результате
образуется более устойчивая кетоформа пировиноградной кисло
ты, а АДФ превращается в АТФ:
2СН 2: СО сю (Н 2 Р0 3) СООН + 2АДФ -* 2СН 3 СОСООН + 2АТФ. (3)
Фосфоэнолпировиноградная Пировиноградная
кислота кислота
10. Пировиноградная кислота под действием фермента пи-
руватдекарбоксилазы (4.1.1.1) декарбоксилируется с отщепле
нием С0 2 и образованием уксусного альдегида:
2CH 3 COCOOH -*2С0 2 + 2СН 3 СНО. (10)
Пировиноградная Уксусный альдегид
11. Уксусный альдегид при участии фермента алкогольдегид-
рогеназы (1.1.1.1) взаимодействует с НАД-Н 2 , образовавшимся
ранее при окислении фосфоглицеринового альдегида в фосфо-
глицериновую кислоту [см. уравнение (5)]. В результате уксус
ный альдегид восстанавливается в этиловый спирт, а кофермент
НАД-Н 2 вновь регенерируется (окисляется в НАД):
2СН 3 СНО + 2НАД Н 2 Z 2СН 3 СН 2 ОН + 2НАД. (11)
Итак, завершающим этапом брожения является реакция восстановления уксусного альдегида в этиловый спирт.
Из рассмотренного цикла реакций спиртового брожения видно, что из каждой молекулы глюкозы образуется 2 молекулы спирта и 2 молекулы С0 2 .
В процессе спиртового брожения образуется четыре молекулы АТФ [см. уравнения (6) и (9)], но две из них затрачиваются на фосфорилирование гексоз [см. уравнения (1) и (3)]. Таким образом, запасается всего 2 г-моль АТФ.
Ранее указывалось, что на образование каждой грамм-молекулы АТФ из АДФ затрачивается 41,9 кДж, а в энергию двух молекул АТФ переходит соответственно 83,8 кДж. Следовательно, при сбраживании 1 г-моль глюкозы дрожжи получают энергии около 84 кДж. В этом и заключается биологический смысл брожения. При полном расщеплении глюкозы на С0 2 и воду выделяется 2874 кДж, а при окислении 1 г-моль глюкозы до С0 2 и Н 2 0 в процессе аэробного дыхания аккумулируется 2508 кДж, так как образующийся этиловый спирт еще сохраняет в себе потенциальную энергию. Таким образом, с энергетической точки зрения брожение - процесс малоэкономичный.
Сбраживание отдельных Сахаров происходит в определенной последовательности, обусловленной скоростью их диффузии в дрожжевую клетку. Быстрее всех сбраживаются дрожжами глюкоза и фруктоза. Однако сахароза как таковая исчезает в сусле (инвертируется) еще в начале брожения. Она гидролизу-ется р-фруктофуранозидазой (3.2.1.26) оболочки дрожжевых клеток с образованием гексоз (глюкозы и фруктозы), которые легко используются клеткой. Когда в сусле почти не остается фруктозы и глюкозы, дрожжи начинают потреблять мальтозу.
Атлас производственных спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII может служить справочным пособием для работников спиртовых заводов, обеспечивающих микробиологический контроль производства. В настоящее время при промышленном производстве продуктов питания с использованием дрожжей применяют, в основном, дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. При производстве хлеба, спирта, вина, хлебного кваса используют различные штаммы (расы) дрожжей. Даже сырье спиртовых заводов (зерно или меласса) влияет на выбор того или иного штамма. При производстве спирта из зерна чаще применяют дрожжи XII расы, постоянным местом обитания которых являются искусственно приготовляемые гидролизованные крахмалистые субстраты. Ведение технологии требует внимательного наблюдения за состоянием дрожжей и наличием посторонних микроорганизмов по участкам производства. Существующие методики позволяют проводить необходимый микроскопический анализ, но без определенной практики сложно идентифицировать полученные данные микроскопического анализа и регламентных показателей технологии.
Как известно, именно дрожжи превращают вещества зерна в этиловый спирт, и их можно рассматривать как одно из многочисленных орудий труда человека, а дрожжевую ферментацию - один из самых древних микробиологических процессов, используемых человеком в своих целях. Первое упоминание о применении дрожжей человеком относится к 6000 г. до нашей эры. Научное изучение дрожжей началось в 1680 г. после изобретения светового микроскопа. Исследователи различных стран описали внешний вид дрожжевых клеток; показали, что дрожжи - это живые организмы; доказали их роль при превращении сахара в спирт; получили чистые культуры дрожжей; классифицировали дрожжевые клетки по способу размножения, потреблению питательных веществ и внешнему виду. Современные оптические микроскопы оснащены сухими и иммерсионными объективами. Оптический микроскоп с сухим объективом позволяет изучать микроорганизмы размером более 5 мкм, иммерсионный микроскоп применяют при исследовании более мелких микроорганизмов. Изобретение электронного микроскопа позволило понять структуру дрожжевой клетки и изучить проявления её генетической системы, поскольку разрешающая способность электронного микроскопа 1,0-0,14 нм.
Микроскоп - незаменимый прибор при производстве спирта и без него невозможно эффективное ведение технологии: с его помощью определяют количество дрожжевых клеток в 1 мл дрожжевой или бродящей массы; процентное количество почкующихся и мертвых клеток; наличие посторонних микроорганизмов; содержание гликогена в клетках (упитанность клеток). Физиологическое состояние дрожжей устанавливают по внешнему виду клеток, что позволяет использовать дешевые световые микроскопы с сухими объективами. Следует отметить, что современное производство спирта не требует микроскопического анализа структуры дрожжевых клеток, однако при изучении внешнего вида клетки под световым микроскопом необходимо иметь представление и ее строении.
Строение дрожжевой клетки
Дрожжевые клетки имеют округлую или эллипсовидную форму с размером в поперечнике от 2,5 до 10 мкм и от 4,5 до 21 мкм в длину. На рис. 1 приведено графическое изображение среза дрожжевой клетки. Клеточная стенка, клеточная мембрана, ядро, митохондрии, вакуоли - структуры клетки, видимые в световой микроскоп с сухим объективом при использовании специфических красителей.
Клеточная стенка представляет собой жесткую структуру толщиной 25 нм, составляет около 25% сухой массы клетки и состоит в основном из глюкана, манана, хитина и белка. Организация клеточной стенки недостаточно изучена, однако современные теории отдают предпочтение модели трехслойной структуры, согласно которой внутренний глюкановый слои отделен от внешнего мананового промежуточным слоем с повышенным содержанием белка.
Клеточная мембрана (плазмалемма) дрожжевой клетки под электронным микроскопом выглядит как трехслойная структура, тесно прилегающая к внутренней поверхности клеточной стенки, и состоит примерно из равного количества липидов и белков, а также небольшого количества углеводов. Клеточная мембрана выполняет роль барьера проницаемости вокруг содержимого клетки и контролирует транспорт растворенных веществ внутрь клетки и из нее.
В изучении ядра достигнуты лишь некоторые успехи, поскольку индивидуальные хромосомы очень малы и не выявляются в виде дискретных структур ни в световом, ни в электронном микроскопах. Дрожжевые клетки имеют одно ядро размером от 2 до 20 мкм. Ядерная мембрана остается неизменной на протяжении всего клеточного цикла. Под электронным микроскопом она выглядит как двойная мембрана, усеянная порами.
Митохондрии - самые большие из клеточных включений сферической или цилиндрической формы размером в поперечнике от 0,2 до 2 мкм и от 0,5 до 7 мкм в длину. Двухслойная оболочка имеет толщину около 20 нм. Количество митохондрий в клетке более или менее постоянно и характерно для данного вида микроорганизмов.
Рис. 1. Графическое изображение среза дрожжевой клетки (в 1 сантиметре 1 микрометр)
Оно меняется в зависимости от стадии развития клетки и функциональной активности от 500 до 2000 тт. Функции митохондрий связаны с переносом электронов, ионов, субстратов внутри клетки. Помимо этого в митохондриях синтезируются вещества, аккумулирующие химическую энергию клетки.
Зрелые дрожжевые клетки содержат большую вакуоль. При образовании почки вакуоль, по всей вероятности, дробится на более мелкие вакуоли, которые распределяются между материнской клеткой и почкой. В дальнейшем эти маленькие вакуоли снова сливаются, образуя по одной вакуоли в материнской и дочерней клетках. Функция вакуоли точно не установлена. В ней содержатся гидролитические ферменты, полифосфаты, липиды, ионы металлов и др. Вакуоль, возможно, выполняет функции резервуара для хранения питательных веществ и гидролитических ферментов.
Внутриклеточное содержимое дрожжевой клетки (за исключением ядра, митохондрий и вакуоли), как известно, называют цитоплазмой, состоящей из воды, липидов, углеводов, различных высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений, минеральных солей и др. Исследование клетки под электронным микроскопом показало сложную структуру цитоплазмы в виде гранул, функции и химические свойства которых достаточной мало не изучены. Цитоплазма играет важную роль в биохимии клетки и находится в тесном взаимодействии с органеллами, которые она окружает.
Отличительная особенность популяции растущих дрожжевых клеток - наличие почек, образующихся при делении клеток. Дочерняя клетка возникает в виде маленькой почки, которая растет в течении большей части клеточного цикла. Рост дрожжей происходит в основном во время формирования почек, поэтому почка к моменту её отделения становится по размеру более или менее такой же, как зрелая клетка (см. рис. 2). Клетки могут разойтись вскоре после деления, однако часто ещё до их расхождения начинаются новые циклы клеточного деления, в результате чего образуются группы клеток. На месте отделения клеток друг от друга остаются следы, называемые у материнской клетки дочерним шрамом, а у дочерней клетки - родовым шрамом. На одном и том же месте клеточной стенки никогда не появляются две почки. Каждый раз почка оставляет новый дочерний шрам на стенке материнской клетки. По числу шрамов можно определить, сколько почек образовала данная клетка, что позволяет оценить возраст клетки. Установлено, что у гаплоидных клеток насчитывается максимально 18, а диплоидных - 32 почечных шрама.
Рис. 2. Графическое изображение почкующейся клетки.
Методы световой микроскопии и микробиологического контроля, используемые в технологии спирта.
В технологии спирта при проведении микроскопического анализа популяции дрожжей световым микроскопом с сухим объективом рассматривают внешний вид клеток методом раздавленной капли в неокрашенном или окрашенном видах (прижизненные препараты), производят подсчет общего количества клеток и процентного количества почкующихся клеток, определяют наличие посторонних микроорганизмов.
Метод раздавленной капли
На предметное стекло наносят каплю исследуемой взвеси с дрожжевыми клетками, которую сверху накрывают покровным стеклом. Полученный образец рассматривают под микроскопом, где микроорганизмы видны в различных плоскостях. Данный метод прост, его применяют при изучении подвижности и внутреннего строения клеток микроорганизмов. Метод раздавленной капли без использования красителей позволяет различать дрожжевые клетки по толщине клеточных стенки и мембраны, состоянию цитоплазмы, наличию или отсутствию вакуолей, процентному количеству почкующихся и мертвых клеток, присутствию молочнокислых бактерий.
Подсчет процентного количества почкующихся клеток
Для определения количества почкующихся клеток на предметное стекло наносят по одной капле дрожжевой суспензии без твердых включений и дистиллированной воды, закрывают покровным стеклом, излишек жидкости отбирают листком фильтровальной бумаги и микроскопируют. У зрелых дрожжей почкуется более 10% клеток.
Пример. Всего в 5 полях зрения обнаружено 33+35+29+32+30=159 дрожжевых клеток, в т. ч. почкующихся 4+5+3+5+3=20. Процентное количество почкующихся клеток составляет 20 х 100/159 = 12,5 (%).
Измерение величин микроорганизмов
Единицей измерения величины микроорганизмов служит микрон (мкм), равный 0,001 миллиметра (мм). При измерении пользуются окуляр-микрометром - круглым стеклом с нанесенной на него шкалой (каждый миллиметр шкалы разделен на 10 делений). Стекло накладывают на диафрагму окуляра так, чтобы сторона с делениями оказалась вверху. Для тарирования значений одного деления окуляр-микрометра используют объект-микрометр, который помещают на столик микроскопа и рассматривают как препарат. Объект-микрометр представляет собой стеклянную пластинку со шкалой, одно деление которой равно 0,01 мм (или 10 мкм). На рис. 3 показано поле зрения микроскопа со шкалами окуляр-микрометра и объект микрометра. По совпадению делений обоих шкал устанавливают масштабный коэффициент для определения истинного значения одного деления окуляр-микрометра. На рисунке с делениями объект-микрометра совпали деления окуляр-микрометра №2 и №8, или 30 делений окуляр-микрометра совпали с 5 делениями объект микрометра (составляющими 50 мкм). Таким образом, одно деление окуляр-микрометра примерно равно 1,67 мкм (50/ 30=1,666...). Если вместо объект-микрометра на столик микроскопа поместить препарат с живыми дрожжами, можно определить их видимые размеры (длину и ширину), рассматривая препарат в те же объектив и окуляр и с тем же выдвижением тубуса. Для этого необходимо установить, какому числу окулярных делений соответствует величина измеряемого объекта, и затем это число умножить на полученное значение масштабного коэффициента (в нашем случае равным 1,67 мкм). Полученные результаты измерений не поддаются математической обработке в соответствии с теорией эксперимента, однако они дают представление о размерах изучаемых микроорганизмов.
Подсчет количества клеток
Для подсчета количества дрожжевых клеток пользуется счетной камерой Горяева представляющей собой толстое предметное стекло с нанесенными на него поперечными прорезями. которые образуют три поперечно расположенные
Рис. 3. Шкалы объект-микрометра и объектив микрометра для измерения величин микроорганизмов под микроскопом
площадки. Средняя из них разделена на две части, на каждой из которых выгравирована сетка (см. рис. 5) площадью 9 мм 2 , разделенная на 225 больших квадратов площадью 0,04 мм 2 каждый (15 рядов по 15 квадратов) и 400 малых квадратов площадью 0,0025 мм 2 каждый (каждый третий ряд больших квадратов в горизонтальном и вертикальном направлении разделен на 16 малых квадратов). Средняя площадка предметного стекла опущена на 0,1 мм относительно двух других площадок, на которые накладывают специальное шлифованное покровное стекло размером 18x18 мм, что обеспечивает создание камеры для дрожжевой суспензии. Количество клеток определяют в соответствии с формулой О = А х К 1 х К 2 х В, где В количество клеток в 1 мл суспензии, шт/мл; А количество клеток в 80 малых квадратах, шт.; К., коэффициент глубины камеры (при глубине камеры 0.1 мм
Рис. 4. Камера Горяева: 1 - предметное стекло; 2 - специальное покровное стекло; 3 - камера для дрожжевой суспензии; 4, 6 - площадка для покровного стекла; 5 - сетка для подсчета дрожжевых клеток; 7 - прорезь для введения дрожжевой суспензии
К 1 = 10; при глубине камеры 0,2 мм К 1 = 5); К 2 -коэффициент пересчета объема, 1/мл (К 2 = 5000 1/ мл); В - коэффициент разбавления пробы (для дрожжей В=10). При подсчете дрожжевых клеток в камере Горяева с глубиной 0,1 мм и десятикратным разбавлением дрожжевой суспензии В = 5 х 10 4 А х В.
В зрелых дрожжах и сбраживаемом сусле (во время главного брожения) количество дрожжевых клеток превышает 80 млн шт/мл.
Подсчет процентного количества мёртвых клеток в дрожжевой суспензии
Для определения количества мёртвых клеток на предметное стекло наносят по одной капле не фильтрованной дрожжевой суспензии и раствора метиленовой сини (1:5000), окрашивающей мертвые клетки в синий цвет. Каплю закрывают покровным стеклом, излишек жидкости собирают листком фильтровальной бумаги и через 2 мин микроскопируют. В поле зрения микроскопа считают общее количество дрожжевых клеток, затем только синие, после чего препарат передвигают и подсчет ведут в новом поле зрения. Таким образом подсчитывают общее количество клеток в пяти полях зрения. После подсчета вычисляют количество мертвых клеток в процентах. В зрелых дрожжах количество мёртвых клеток не должно превышать 1%. Пример. Всего в пяти полях зрения обнаружено 43+45+39+42-40=209 дрожжевых клеток, в т. ч. окрашенных в синий цвет 1 +0+0+0+1=2. Процентное количество мёртвых клеток составляет 2 х 100/209 = 0,96 (%).
Рис. 5. Сетка для подсчета дрожжевых клеток в камере Горяева: 1 - большой квадрат; 2 - малый квадрат
Определение содержания гликогена в дрожжевых клетках
При нормальной технологии в дрожжах накапливается гликоген, когда 2/3 сахара сусла сброжены и дрожжи пригодны для использования в производстве. Для определения количества гликогена в дрожжевых клетках на предметное стекло наносят каплю нефильтрованной дрожжевой суспензии и 2 капли 0,5%-ного раствора йода (0,5 г йода и 1 г KJ на 100 мл воды), капли смешивают, накрывают покровным стеклом, отбирают излишек жидкости листком фильтровальной бумаги и микроскопируют. При соотношении дрожжевой суспензии и раствора йода 1:2 через 2-3 мин клетки окрашиваются в светло-желтый цвет, а гликоген - в коричневый. Применять более крепкий раствор йода, чем 1%-ный, нельзя, так как он окрашивает в коричневый цвет не только гликоген, но и всю клетку. У зрелых дрожжей гликоген занимает от 1/3 до 2/3 клеток.
Определение бактериальной инфекции
Для определения процентного содержания бактериальной инфекции (в первую очередь молочнокислых бактерий) из пробы дрожжей берут одну каплю дрожжевой суспензии без твердых включений и помещают ее на предметное стекло, куда добавляют одну каплю дистиллированной воды. Обе капли смешивают и накрывают предметным стеклом, удаляя излишек жидкости листком фильтровальной бумаги, и микроскопируют. Поскольку производственные дрожжи ведут в нестерильных условиях по методу естественно чистой культуры, то в них всегда можно обнаружить некоторое количество бактерий. При нормальной технологии в сернокислых дрожжах в поле зрения микроскопа (с объективом х40 и окуляром х7 и более) находят от 1 до 3 клеток бактерий, среди которых обычно не бывает подвижных форм. Наличие в поле зрения микроскопа большего количества бактерий говорит о нарастании кислотности в производственных дрожжах или в сбраживаемом сусле. Спороносные подвижные формы бактерий при закисании дрожжевого затора обычно не развиваются вследствие накопления этилового спирта.
Внешний вид дрожжевых клеток
Покоящиеся дрожжи чистой культуры, молодые, зрелые, старые, голодающие и мертвые клетки можно определить по их размерам и форме, строению и внутреннему содержимому.
Размер и форма дрожжевых клеток
В среднем размеры клеток дрожжей расы XII составляют 6x9 мкм, однако в зависимости от условий среды, возраста и условий развития (кислотность, доступ кислорода и т.п.), их фактические размеры имеют отклонения в большую и меньшую стороны. Формы дрожжей одной расы определяются, в основном, условиями развития. Клетки имеют овальную форму при культивировании на зерновом сусле; при росте на твердой среде все расы дрожжей дают более или менее вытянутые клетки; несколько удлиненную форму имеют также дрожжи в момент интенсивного развития.
Строение и внутреннее содержимое клетки
При микроскопическом анализе дрожжевых клеток следует обращать внимание на толщину оболочек; вид цитоплазмы; наличие в клетки вакуолей и гликогена; количество в популяции мёртвых клеток. У молодых клеток толщина оболочки мало заметна, а у старых выступает в виде хорошо видимого ободка, который при дальнейшем старении становится двуконтурным. Вид цитоплазмы может быть однородный или зернистый. Зернистость большей частью характерна для старых, больных и развивавшихся в ненормальных условиях (высокая температура или перемена температур, высокая кислотность, инфекция) клетках. Отставание цитоплазмы от оболочки клетки бывает при плазмолизе или свидетельствует о разрушении клетки. Количество гликогена в дрожжах непостоянно и зависит от их возраста. Наибольшее количество гликогена накапливается у зрелых дрожжей.
Вид дрожжевых клеток под объективом микроскопа в зависимости от их возраста
Внешний вид и содержимое клеток |
Возраст дрожжевых клеток |
|||||
Покоящиеся (чистая культура) |
Молодые (незрелые) |
Зрелые |
Перезрелые (старые) |
Голодающие |
Мертвые |
|
Овальная |
Овальная |
Овальная |
Клетки съеживаются |
Клетки съеживаются |
||
Размер |
Крупные |
Уменьшаются в размерах |
Уменьшаются в размерах |
|||
Почкующиеся клетки |
Нет или единичные |
Почкуется 10 % |
Почкуется 10 % |
Нет или единичные |
||
Оболочка |
Очень тонкая |
Очень тонкая |
Четко очерченная |
Толстая или двуконтурная |
Толстая или двуконтурная |
Расплывается и распадается |
Цитоплазма |
однородная |
Нежная и однородная |
Неоднородная или зернистая |
Сильно зернистая |
Сильно зернистая |
Комковатая |
Вакуоли |
Иногда занимает всю клетку |
|||||
Гликоген |
В единичных клетках |
Занимает меньше 1/4 клетки или отсутствует |
Занимает от 1/3 до 2/3 клетки |
В небольших количествах |
Отсутствует |
Отсутствует |
Вид дрожжевых клеток в зависимости от возраста
У молодых дрожжей оболочка очень тонкая, цитоплазма нежная и однородная. Вакуолей нет или видны малые вакуоли у небольшого количества клеток. Гликоген в единичных клетках. Зрелые дрожжи имеют четко очерченные оболочки. Заметно 10-15% клеток с почками. В цитоплазме видна неоднородность, зернистость, появляются средние по величине вакуоли, в клетках содержится много гликогена. Количество мёртвых клеток не превышает 1%. У перезрелых дрожжей отчетливо видна толстая оболочка при сильной зернистости цитоплазмы. Большие вакуоли занимают почти всю клетку. Если дрожжам не хватало питательных веществ, то клетки уменьшаются в размерах. Почкуются единичные клетки. Процент мёртвых клеток по мере старения прогрессивно увеличивается.
Оболочки голодающих дрожжей толстые (у некоторых клеток оболочки имеют переменную толщину), их содержимое зернисто. Клетки уменьшаются в размерах, съёживаются, немного удлиняются. Вакуоли отсутствуют, гликогена нет. Отмирание и разрушение дрожжей происходит в несколько стадий. Цитоплазма становится комковатой, но прилегает к хорошо видимой оболочке. Затем оболочка расплывается и распадается. Протоплазма становится ещё более зернистой и распадается на мелкие части. Иногда оболочка остаётся, но протоплазма отстаёт от неё, собирается комком в центре, клетка удлиняется, принимает неправильную форму и разрушается. В таблице приведены данные о внешнем виде дрожжевых клеток в зависимости от их возраста.
Внешний вид дрожжевых клеток при дрожжегенерации
При пуске завода (при освоении производства, в начале сезона или при инфицировании оборудования) дрожжи готовят из чистой культуры, поступающей на завод в пробирке. Разведение чистой культуры производят путем последовательного переноса клеток из пробирки в колбу емкостью 500 мл, затем в пятилитровую бутыль и маточник, откуда дрожжи поступают в дрожжанку, где приготавливают производственные дрожжи.
Чистая культура дрожжей
На рис. 6 приведено изображение поля зрения микроскопа с дрожжевыми клетками, перенесенными из пробирки с чистой культурой в колбу с суслом. Оболочки клеток очень тонкие, цитоплазма нежная и однородная, вакуолей нет. В поле зрения микроскопа нет молочнокислых бактерий, что говорит о хорошем качестве чистой культуры дрожжей. На рис. 7 дрожжи из колбы 500 мл после 24 ч роста. Тонкие оболочки, однородная цитоплазма клеток и отсутствие в ней вакуолей говорят о молодости дрожжей. Отсутствие молочнокислых бактерий в поле зрения микроскопа и большое количество делящихся клеток (более 15%) ещё раз подтверждают хорошее качество чистой культуры.
Производственные дрожжи
Качество дрожжей перед передачей их в производство определяют по количеству почкующихся клеток, наличию в дрожжах молочнокислых бактерий, количеству мёртвых клеток, упитанности дрожжей (количество гликогена в клетках), количеству клеток в 1 мл дрожжей. На рис. 8-11 приведены изображения полей зрения микроскопа с пробами зрелых дрожжей из одной дрожжанки при определении их качества перед передачей в производство.
На всех изображениях крупные клетки овальной формы с четко очерченными оболочками и зернистой цитоплазмой. Почкуется более 10% клеток, а в поле зрения микроскопа не более 3 клеток молочнокислых бактерий (см. рис. 8). Количество мёртвых клеток не превышает 1% (см. рис. 9). Содержание гликогена говорит об упитанности дрожжей (см. рис. 10). Количество дрожжевых клеток составляет 120 млн. шт./мл (см. рис.-11). На основании проведенного анализа можно сделать только один вывод: дрожжи в дрожжанке хорошего качества и их можно передавать в производство.
В некоторых случаях происходит инфицирование дрожжей, в первую очередь молочнокислыми бактериями. На рис. 12 приведено изображение поля зрения микроскопа с пробами зрелых инфицированных дрожжей. Крупные клетки овальной формы с четко очерченными оболочками и зернистой цитоплазмой. Почкуется значительное количество клеток, однако в поле зрения микроскопа больше 3 клеток молочно кислых бактерий. Подобные дрожжи не пригодны для использования в производстве.
При остановке спиртовых заводов (отсутствие сбыта готовой продукции или капитальный ремонт) дрожжи хранятся при температуре 10...12°С в течение нескольких месяцев. На рис. 13 приведено изображение поля зрения микроскопа с пробой захоложенных дрожжей из дрожжанки, которые хранились при температуре 7... 10 °С в течение 45 сут. Дрожжевые клетки различаются по размерам и форме. Одни клетки имеют овальную форму и гонкие оболочки с однородной цитоплазмой, как молодые или зрелые клетки. Другие клетки потеряли форму, оболочки толстые переменной толщины, цитоплазма сильно зернистая, что позволяет отнести их к голодающим и перезрелым клеткам. Захоложенные дрожжи применяют в производстве. На рис. 14 приведено изображение поля зрения микроскопа с пробой зрелых дрожжей из дрожжанки, при выращивании которых использовали захоложенные дрожжи. Клетки крупные, овальной формы, с четко очерченными оболочками и зернистой цитоплазмой. Некоторые клетки почкуются, количество клеток молочнокислых бактерий не превышает нормы. Две клетки имеют разрушенные оболочки. По всей вероятности, это остатки клеток захоложенных дрожжей. Дрожжи пригодны для использования в производстве.
Рис. 6. Чистая культура дрожжей
Рис. 7. Чистая культура дрожжей спустя 1 сутки
Рис. 8. Зрелые дрожжи из дрожжанки
Рис. 9. Зрелые дрожжи (подсчет процентного количества мертвых клеток)
Рис. 10. Зрелые дрожжи (определение упитанности дрожжей)
Рис. 11. Зрелые дрожжи (подсчет количество клеток в одном миллилитре дрожжей)
Рис. 12. Зрелые инфицированные дрожжи
Рис. 13. Зрелые дрожжи из дрожжанки после 45-суточного хранения при температуре 7.. .12 °С
Рис. 14. Зрелые дрожжи из дрожжанки, выращенные из захоложенных дрожжей
Внешний вид дрожжевых клеток при сбраживании сусла
При сбраживании сусла проведение микроскопического анализа целесообразно в случае нарастания титруемой кислотности бражки при брожении более чем на 0,2 °К (закисании бражки). На рис. 15 приведено изображения поля зрения микроскопа с пробой из закисшего бродильного чана (периодическая схема сбраживания сусла, 72 ч брожения). Поскольку сбраживание сусла окончено, то анализ внешнего вида и внутреннего содержимого дрожжевых клеток не дает результата. Большое количество молочнокислых бактерий в поле зрения микроскопа говорит о бактериальном закисании бродильного чана.
Рис. 15. Инфицированная бражка из бродильного чана
В настоящее время спиртовые заводы применяют несколько технологических схем производства спирта из зерна, отличающихся температурой тепловой обработки сырья: с использованием аппаратов типа «Генц» - до 165 °С; агрегатов непрерывного разваривания (Мичуринская схема) - до 150 °С; аппаратов гидродинамической обработки замеса - до 95 °С. Помимо этого спиртовые заводы применяют различные осахаривающие материалы: солод; неочищенные ферментные препараты, получаемые в условиях спиртового завода; очищенные ферментные препараты, производимые специализированными биохимическими заводами. Способы тепловой обработки замеса и используемые ферментные препараты влияют на все технологические показатели, в т. ч. на показатели приготовления дрожжей и сбраживания сусла. В атласе даны рекомендации по использованию микроскопического анализа при производстве спирта из зерна с применением аппаратов гидродинамической обработки замеса, очищенных ферментных препаратов и сернокислых дрожжей.
Инфицирование чистой культуры дрожжей
Микроскопический анализ пробы дрожжей из пробирки с чистой культурой или колбы после 20 ч роста показал наличие в полях зрения микроскопа молочнокислых бактерий. Чистая культура дрожжей инфицирована (как правило, это происходит при длительном хранении в условиях высоких температур). Необходимо поменять чистую культуру дрожжей. При повторном выявлении инфекции в чистой культуре целесообразно поменять поставщика чистой культуры дрожжей.
Инфицирование производственных дрожжей
Микроскопический анализ пробы зрелых дрожжей из дрожжанки показал наличие в поле зрения микроскопа более 3 клеток молочнокислых бактерий, что говорит об инфицировании зрелых дрожжей. Инфицирование дрожжей происходит в результате следующих основных причин: использование некачественного зерна; применение воды из открытых водоемов (особенно в теплое время года); использование некачественных ферментных препаратов; некачественная мойка и стерилизация оборудования и трубопроводов; нарушения регламентных показателей приготовления дрожжей; эксплуатация устаревшего оборудования на заводе.
В себестоимости спирта стоимость зерна занимает 40-60% и использование дешевого зерна улучшает экономические показатели производства. Однако при применении некачественного сырья возникают потери спирта в результате инфицирования. Целесообразно использовать зерно с качеством не ниже первой степени дефектности: зерно, вышедшее из стадии покоя; проявляющее усиленные физиологические процессы (дыхание), способствующие жизнедеятельности микроорганизмов; имеющее солодовый или гнилистый запахи, однако пригодное для производства. При необходимости переработки некачественного зерна температуру тепловой обработки замеса следует повысить до 130...135 °С.
При применении воды из открытых водоемов в теплое время года температуру тепловой обработки замеса можно повысить до 130...135 °С. Предпочтительно использовать воду питьевого качества из водопровода или артезианской скважины. Целесообразно применять способы обеззараживания воды или замеса путем их обработки магнитными и другими излучениями, используемыми в пищевой и медицинской промышленностях при обработке продуктов питания и медицинской техники.
Если не удается найти источник инфицирования зрелых дрожжей, то проверяют ферментные препараты на их бактериальную зараженность. В первую очередь инфицированными оказываются ферменты. производимые в условиях спиртовых заводов и неочищенные (в жидком виде) транспортируемые автомобильным или железнодорожным транспортом (особенно в жаркое время года). При инфицировании ферментных препаратов их заменяют на качественные и меняют поставщика ферментов.
Мойку оборудования при дрожжегенерации осуществляют щетками и водой из шлангов (давление 3-4 кг/см 2) с последующей стерилизацией паром. Расход пара составляет 10-12 кг на 1 м дрожжанки при 30-минутном пропаривании. Мойку трубопроводов проводят различными моечными растворами с последующей стерилизацией паром. Наиболее сложные для мойки и стерилизации внутренние змеевики. Змеевики охлаждения дрожжанок целесообразно заменить на рубашки охлаждения, а мойку внутренней поверхности проводить теплой водой поддавление 120-150 кт/см: с использованием очистителей высокого давления. Наибольший эффект от применения подобных очистителей достигается при мойке сварных стыковых и угловых швов внутри оборудования, а также при мойке внутренней поверхности дрожжанок с коррозионными раковинами. Использование очистителей позволяет уменьшить расход пара и моющих растворов, а также исключить ручной труд при мойке внутренних поверхностей оборудования щетками.
Мойку и стерилизацию трубопроводов осуществляют в соответствии с регламентом. Наиболее затруднительны мойка и стерилизация теплообменников типа «труба в трубе», охлаждающих осахаренную массу с 52...60 °С (в зависимости от используемых ферментов) до 22...28 °С (в зависимости от применяемых дрожжей), особенно если часто происходит остановка насосов, перекачивающих замес в осахариватель, что приводит к задержке массы в теплообменнике. Теплообменник типа «труба в трубе» целесообразно заменить на пластинчатый теплообменник, который в десятки раз меньше по габаритам, изготовлен из нержавеющей стали и его легко мыть в разобранном состоянии и стерилизовать.
При приготовлении дрожжей необходимо придерживаться показателей технологического регламента. Наиболее трудно обеспечить подачу в змеевики дрожжанок достаточного количества воды (особенно в теплое время года) и без задержек передавать зрелые дрожжи в бродильный чан. Замена охлаждающих змеевиков на рубашку охлаждения позволяет в несколько раз увеличить поверхность охлаждения дрожжанки и при нехватке холодной воды достичь охлаждения дрожжевой массы до необходимой температуры. Имея значительную поверхность охлаждения в дрожжанках можно добиться своевременной подачи дрожжей в бродильный чан за счет изменения температуры дрожжегенерации. Снижение температуры дрожжегенерации до 25...27 °С обеспечивает увеличение сроков приготовления дрожжей, а увеличение температуры дрожжегенерации до 30...32 °С ускоряет приготовление дрожжей.
В технологии спирта емкостное оборудование, как правило, изготавливают из черной стали с толщиной стенок 5-8 мм. Большая толщина стенок позволяет использовать дрожжанки и трубопроводы до 25 лет без ремонта. За это длительное время на стенках дрожжанок по различным причинам образуются раковины (коррозия металла, кавитационные процессы в жидкости, усталость металла), которые плохо отмываются и способствуют инфицированию зрелых дрожжей. Необходимо вовремя менять оборудование (один раз в 6-7 лет эксплуатации) и, тем самым, исключать очаги инфицирования дрожжей.
Недостаточная упитанность дрожжевых клеток
Микроскопический анализ пробы зрелых дрожжей из дрожжанки показал, что гликоген в клетках занимает менее 1/4 внутреннего содержимого, а клетки дрожжей уменьшились в размерах. Указанное говорит о том, что дрожжи или не дозрели и их рано передавать в производство или они перестояли и клеткам необходимо дополнительное питание. В первом случае достаточно увеличить время дрожжегенерации. Во втором целесообразно проверить продолжительность гидродинамической обработки зернового замеса (полноту заполнения аппарата гидродинамической обработки замеса в соответствии с регламентом), от чего зависит количество растворимых сухих веществ сырья и, в особенности, растворение белков зерна, поскольку недостаток азотистого питания снижает бродильную активность дрожжей; правильность дозирования ферментов в осахаривателе. При недостатке азотистого питания можно, использовать карбомид, который учитывается и дозируется, исходя из содержания в нем азота.
Повышенное количество мертвых клеток
Микроскопический анализ пробы зрелых дрожжей выявил, что содержание мёртвых клеток превышает 1% от общего числа дрожжей. Сверхнормативное отмирание дрожжевых клеток происходит при повышении температуры во время дрожжегенерации выше регламентной (30 °С) или при повышении кислотности дрожжевого сусла (выше 1,1 °К). Целесообразно проконтролировать выполнение регламентных показателей дрожжегенерации.
Уменьшенное количество клеток в 1 мл дрожжей и недостаточное количество почкующихся клеток
Подсчет количества дрожжевых клеток под микроскопом показал, что их содержание в дрожжах 80 млн шт/мл, а подсчет количества почкующихся клеток выявил, что в поле зрения микроскопа менее 10% почкующихся дрожжей. Необходимо проверить выполнение всех регламентных показателей, качество зерна, ферментов, серной кислоты (определить наличие в ней мышьяка). Следует заменить некачественное сырьё и вспомогательные материалы.
Инфицирование сбраживаемого сусла
Микроскопический анализ пробы сбраживаемого сусла показал наличие большого количества молочнокислых бактерий. Следует ожидать уменьшение выхода спирта из 1 тонны зерна, поскольку питательные вещества сырья перерабатываются бактериями в молочную кислоту. Причинами инфицирования бражки могут быть: нарушение регламентных показателей при брожении; необоснованное увеличение времени сбраживания сусла, когда количество несброженных углеводов в бражке составляет менее 0,65 г/100 мл (при гидродинамической обработке замеса после 48-60 часов сбраживания), а бражка продолжает выдерживаться в бродильном чану до 72 часов; недостаток охлаждающей воды.
При нарушении регламентных показателей сбраживания сусла и необоснованном увеличении времени сбраживания достаточно провести организационные мероприятия, обеспечивающие технологическую дисциплину на предприятии. При недостатке охлаждающей воды необходимо осуществить технические мероприятия. Применение рубашек охлаждения вместо змеевиков позволяет в несколько раз увеличить поверхность охлаждения бродильных чанов, что значительно снижает потребление воды. На заводах, применяющих для охлаждения бражки выносные теплообменники типа «труба в трубе», целесообразно заменить их на пластинчатые теплообменники, что позволит более эффективно охлаждать бражку не изменяя температуру охлаждающей воды. Недостатки охлаждающей воды можно возместить снижением ее температуры, путем внедрения градирен и холодильных установок.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При производстве спирта основным компонентом технологии служат дрожжи, требующие большого внимания и ответственного отношения обслуживающего персонала, что возможно только при помощи микроскопического анализа как отдельных клеток, так и дрожжевой популяции в целом. По внешнему виду клеток можно определить физиологическое состояние дрожжей и внести коррективы в технологию. Авторы считают, что приведенные в настоящем атласе изображения дрожжей под микроскопом облегчат работу обслживающего персонала спиртовых заводов при разведении чистой культуры дрожжей, дрожжегенерации и сбраживании сусла.
Литература
1. ГУ 9182-160-00008064-98. Чистая культура дрожжей. Расса XII.
2. Павлович С.А. Медицинская микробиология. -Минск: Вышейшая школа, 1997. 133 с.
3. Яровенко и др. Технология спирта. -М.: Колос, 1996. 464 с.
4. Терновский Н^С. и др. Ресурсосберегающая технология в производстве спирта. -М.: Пищевая промышленность, 1994. 168 с.
5. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. -М.: Мир, 1987. 411 с.
6. Рухлядева А.П. и др. Инструкция по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства. -М.: Агропромиздат, 1986. 399с.
7. Бачурин П.Я., Устинников Б.А. Оборудование для производства спирта и спиртопродуктов. -М.: Агропромиздат, 1985. 344 с.
8. Берри Д. Биология дрожжей. -М.: Мир, 1985. 95 с.
9. Коновалов С.А. Биохимия дрожжей. -М.: Пищевая промышленность, 1980. 272 с.
10. Селибер Г.Л. Большой практикум по микробиологии. -М.: Высшая школа, 1962. 420 с.